TST dysfunction，也被称为衰竭exhaustion，被认为是由数天至数周的慢性T细胞抗原受体(TCR)刺激引起的。
肿瘤特异性CD8+ T细胞(TST)在癌症患者中功能失调，无法抑制肿瘤进展。TST dysfunction，也被称为衰竭exhaustion，被认为是由数天至数周的慢性T细胞抗原受体(TCR)刺激引起的。然而，我们对CD8+T细胞功能、细胞分裂和激活后数小时内的表观遗传重塑之间的相互作用知之甚少。
作者评估了荷瘤小鼠和急性感染小鼠的早期CD8+T细胞分化、细胞分裂、染色质可及性chromatin accessibility和转录transcription。令人惊讶的是，尽管有强大的激活和增殖，TST在细胞分裂之前就有几乎完全的效应功能损伤efector function impairment，并且获得了先前与后期功能障碍/衰竭相关的标志性染色质可及性特征hallmark chromatin accessibility features。
主要结果
1、肿瘤特异性T细胞TST经历强大的激活和增殖，但不获得效应功能
为了确定增殖和分化到功能或功能障碍状态之间的关系，用CFSE标记了未成熟的SV40大T抗原(TAG)特异性CD8+T细胞(T细胞抗原受体(TCR)TAG)，允许细胞分裂跟踪，并将其转移到标签驱动的肝肿瘤小鼠(ASTxAlb-Cre)中，或转移到表达SV40抗原表位（TAG epitope-expressing）的单核细胞增生李斯特菌(LMTAG)感染的C57BL/6小鼠( TAG epitope-expressing Listeria monocytogenes (LMTAG)-infected C57BL/6 mice)。
分析转移后12、36、48和60 h的TCRTAG，以捕获处于分裂各个阶段的T细胞(图1b)。
a实验方案: CFSE-labeled naive TCRTAG (Thy1.1) 过继转移至B6 (Thy1.2)， LMTAG-infected B6 (Thy1.2)或 ASTxAlb-Cre (Thy1.2) mice bearing late-stage liver tumors晚期肝肿瘤小鼠。
分别于12 h、36 h、48 h和60 h从感染的脾脏或肝脏肿瘤中重新分离TCRTAG进行流式细胞术分析(体内初始(N;灰色);效应(E：绿色);肿瘤(T：蓝色)。
b在每个时间点(上)评估TCRTAG CFSE稀释度。
荷瘤宿主(T)和感染宿主(E)中的T细胞都经历了非常强劲的细胞分裂(60小时内分裂6个以上)，激活marker CD69和CD44表达上调，图1b,c。
E-TCRTAG和T-TCRTAG均上调LAG3和PD-1，反映激活的TCR信号;
注：SV40是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒。是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA或RNA）型，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物。猿猴病毒40 (SV40)是一种小型的含DNA的肿瘤病毒。其基因产物之一， the large tumour antigen (T-ag)，对病毒复制和细胞转化都是必不可少的。SV40 T-ag可被认为是双癌基因蛋白;它是一种复合转化蛋白，在不同的亚细胞位置提供不同的功能。
Simian virus 40 (SV40) is a small, DNA-containing tumour virus. One of its gene products, the large tumour antigen (T-ag), is essential for both viral replication and cell transformation. SV40 T-ag can be considered a dual oncogene protein; it is a composite transforming protein that provides distinct functions at different subcellular locations.
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monoc ytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌，能引起人和动物较为严重的感染症状。
d、TCR TAG体外刺激4小时后IFN-γ和TNF的产生，通过流式细胞术检测。
e，体外刺激TAG肽后(E48/60 h和T48/60 h) TNF+、IFN-γ+、CD107a+、CD8+Thy1.1+TCRTAG的百分比，以及GZMB和PRF1立即体外表达。
T-TCRTAG在ASTxAlb-Cre宿主的肿瘤、肿瘤引流淋巴结和脾脏中表现出类似的增殖和免疫表型变化。尽管有强大的激活和增殖，T-TCRTAG在体外完全不能产生IFN-γ和TNF，以响应TAG抗原肽的再刺激；这种失败早在 division 1就观察到了(图1d,e)。
这与来自感染小鼠肝脏或脾脏的E-TCRTAG形成鲜明对比，E-TCRTAG能够产生效应细胞因子(IFN-γ/TNF)和细胞溶解分子(GZMB/PRF1)。
因此，肿瘤抗原刺激驱动了CD8T细胞活化和增殖，但没有获得效应功能。
2、肿瘤特异性T细胞TST效应功能损伤在细胞分裂前开始
a实验方案:将CFSE标记的naive TCRTAG (Thy1.1)过继转移至B6 (Thy1.2)、lmtac感染的B6 (Thy1.2)或ASTxAlbCre (Thy1.2)小鼠体内，并于转移后6、12、18 h分别从肿瘤肝脏(T蓝色)和感染脾脏(E绿色)中分离淋巴细胞，流式分析。
b，各时间点live CD8+Thy1.1+TCR TAG CFSE稀释度的代表性直方图(左)和CD69表达的直方图和汇总图(右)，与体内naive相比(N;灰色)
鉴于TST效应功能损伤在少数细胞分裂中很明显，作者评估了细胞分裂6小时、12小时、18小时。
T-TCRTAG在6小时内被激活，虽然E-TCR TAG在这些早期时间点产生了效应细胞因子，但T-TCRTAG在6小时内显示TNF的损失和诱导IFN-γ的失败，在12小时内几乎完全无法产生这两种细胞因子(图2c,d)。
T-TCRTAG也不能产生GZMB(图2d)。因此，与感染激活的T细胞相比，TST中效应功能在激活后数小时内受损。
3、效应CD8+T细胞在荷瘤的宿主中迅速失去功能
a、实验方案:将TCR TAc转移到LM tac感染的B6小鼠体内，并在转移后5 d (E5 d)收集脾细胞，产生承诺效应物。E5 d经CFSE标记，转移到时间匹配的感染小鼠或荷瘤小鼠体内。TCRTAG从感染(绿色)或荷瘤(蓝色)继发受体中分离出来，在转移后12小时、36天和7天。
b, CFSE增殖和CD127表达的代表性直方图。
(图3a):将CFSE标记的第5天效应物TCRTAG (E5d)从LMTAG-infected B6小鼠中转移到 tumor-bearing ASTxAlb-Cre (E → T) 小鼠或 time-matched LMTAG-infected B6 (E → E) 小鼠中，并在12小时、36小时和7天后进行分析。
(图3b):E → E reexpressed CD127 (IL7R) and remained IFN-γ/TNF double producers in the liver (Fig. 3c,d),表明E5d是功能性效应因子，经历了记忆分化，并且不受转运到肝脏微环境的负面影响。
(图3b-d)相反，E → T proliferated after transfer but began losing cytokine production capacity within 12 h, with complete loss by 7 d.
E → T 表现出典型的功能障碍/衰竭的分层进展，首先是TNF的丢失, 然后是IFN-γ(3c).
4、初始和效应TST在转移性黑色素瘤小鼠中增殖强劲，但缺乏效应功能。
为了检验TST效应功能的快速丧失是否发生在其他抗原特异性不同的癌症类型/组织中，采用了肺黑色素瘤转移模型。
通过静脉注射，表达CD8+ T细胞识别的ovalbumin257–264 epitope与EGFP (B16-ova)融合的B16小鼠黑色素瘤细胞，在B6小鼠中诱导转移。
将未成熟的OVA特异性TCR转基因CD8+ T细胞(TCROTI)过性转移到B16-OVA-bearing or LMOVA-infected B6，并在16 h和48 h后进行分析(图4a)。
(Fig. 4b)T-TCROTI and E-TCROTI CD69和PD1表达上调，很快被激活。48h，T-TCROTI 和 E-TCROTI扩增迅速，且CD44和LAG3表达上调 。
(Fig. 4c,d)尽管有增殖， T-TCROTI 还是不能分泌TNF、IFN-γ，只能产生极少量的 GZMB。相反， E-TCROTI 在激活后16h能分泌TNF, IFN-γ 和GZMB，变得更具备效应功能。
然后测试OVA特异性效应T细胞是否会在肺黑色素瘤转移的宿主中失去功能。从LMOVA-infected B6小鼠中过继转移CFSE标记的day 5 effector TCROTI (E5d) ，并将其过继转移到time-matched LMOVA-infected小鼠(E→E)或肺B16-OVA转移的B6小鼠 (E → T)。
(Fig. 4f,g)转移24h后, E → T-TCROTI 开始丢失 TNF和IFN-γ的分泌功能, 相反， E → E-TCROTI有很强的效应功能。这些发现提示，TST功能障碍的快速发作并非肝脏微环境或肝脏肿瘤所特有，而可能发生在不同组织、不同肿瘤类型和抗原特异性的其他晚期癌症中。
5、功能障碍相关的表观遗传编程在细胞分裂之前开始
在TST中发现分裂前功能障碍，那功能障碍相关的表观遗传重塑是否也发生在细胞分裂之前？
(图5a):将CFSE标记的TCRTAG转移到携带肿瘤的ASTxAlb-Cre或LMTAc-感染的B6小鼠中，对分裂前T-TCRTAG(来自肝脏肿瘤6h、12h、24h)和E-TCRTAG(来自脾脏6h、12h、24h)进行分类，并通过转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)和RNA测序(RNA-seq)评估染色质可及性。
(图5b):ATAC-seq和RNA-seq数据的主成分分析(PCA)显示，在6h内，T-TCRTAG和E-TCRTAG具有不同的染色质可及性chromatin accessibility和基因表达谱。
(图5b,c):激活后的前6小时发生了最多的染色质重塑变化chromatin remodeling changes，在12小时和24小时发生的变化较少。
(图5d)：64%的差异可及染色质峰(DAC)在E-TCRTAG和T-TCRTAG之间共享，包括TCR信号下游基因(Irf4, Nfatc2, Nfkb1, Lat)。与E-TCRTAG相比，T-TCRTAG中大量的峰更容易被差异访问(21%;图5 d)。Pdcdl在转录起始位点(-23-kb)上游23 kb处含有一个增强子峰，先前显示在肿瘤中功能失调/耗尽的T细胞和慢性病毒感染期间优先打开。
肿瘤细胞激活后6小时内更容易获得23kb“衰竭”相关的Pdcd1峰。
为了确定驱动早期染色质重塑差异的潜在TF，使用ChromVar对E6 -24小时和T6-24小时之间的DAC进行基序分析。
(图5e)：与炎症细胞因子诱导的TF相关的基序，如STAT家族成员，在早期E-TCRTAGDAC中优先富集，这与Listeria菌诱导的先天免疫激活一致。
通过RNA-seq检测表达情况发现，与T-TCRTAG相比，E-TCRTAG中含有STATI基序的差异表达基因(DEGs)较多，且基因表达变化主要与峰值变化方向相关。
基因测序分析(GSEA)显示，在感染小鼠和荷瘤小鼠中，与未激活TCRTAG相比，早期激活的TCRTAG与T细胞活化相关的基因共享富集。T-TCRTAG和E-TCRTAG也共享嘌呤/嘧啶代谢、MYC靶点、翻译、糖酵解和氧化磷酸化相关的基因集富集，已知TCR激活后会诱导这些基因集。当比较T-TCRTAG和E-TCRTAG时，发现早期的E-TCRTAG富含与IFN-α和IFN-γ反应相关的基因集(图5f)，这与DAC中STAT TF基序的富集一致(图5e)。相反，在没有信号3/炎症刺激的T细胞中表达的基因组在早期T- TCR TAG中富集(图5f)。这些分析表明，在感染宿主和荷瘤宿主中激活的T细胞受到类似的TCR刺激；然而，在荷瘤宿主中激活的T细胞不能接收感染宿主中存在的炎症细胞因子信号。
6、分裂前肿瘤诱导的肿瘤特异性T细胞染色质重塑随着时间和肿瘤抗原暴露而增强
随着时间/肿瘤抗原的增加，染色质重塑得到加强。
研究分裂前功能障碍相关的染色质可及性变化是否会随着时间和持续的抗原暴露而维持或演变。
比较T6h-T24h的染色质可及性与之前发表的5-60 d后从肝脏肿瘤中分离的TCRTAG的染色质可及性数据。还在5d (T5d)和10d (T10d)后对从ASTxAlb-Cre中分离的TCRTAG进行了ATAC-seq。
图6a: PCA显示，TST染色质可及性根据肿瘤暴露时间分为早期(6-24 h)、中期(5-10 d)和晚期(14-60+ d)三组。
来自恶性肝病变(ASTxAlb-Cre)的T5d与从恶性肝病变前分离的T5d具有相似的染色质可及性谱(ASTxCreERT2;6)。
TST DAC的最大变化发生在6小时内，在24小时至5天之间发生另一轮大变化，在7天至14天之间发生第三轮小变化，之后几乎没有染色质重塑(图6b)。
急性感染组TCRTAG在6 h内出现多次早期峰值变化，在24 h-5d出现第二轮峰值变化;然而，与经历第三波染色质重塑(可能是由持续的肿瘤抗原暴露驱动)的肿瘤中的TST相比，E5d后几乎没有出现峰值变化.
7、肿瘤抗原暴露的持续时间决定了功能障碍的稳定性和印迹stability and imprinting
鉴于观察到TCRTAG的许多染色质可及性变化随着肿瘤/抗原暴露的增加而稳定和/或增强，接下来要问的是，从肿瘤中移除并转移到无肿瘤宿主的TCRTAG是否会保留功能、免疫表型和表观遗传功能障碍的特征。
TCRTAG分别于15d、15d和10d (T24h、T5d和T10d)后从肝脏肿瘤中分离，并在无肿瘤B6小鼠(P24h、P5d和P10d)中放置5d(图7a)。在进行功能和免疫表型分析的同时对前后样本进行了ATAC-seq分析。在转移前，肿瘤激活的TCRTAG不能产生细胞因子(图7b)。
5d后，P24h内PD-1均下调(图7c)，但仍有35-40%无法产生TNF或IFN-γ(图7b、d)。
随着肿瘤暴露时间的延长，更多的TCRTAG“印记”效应功能丧失‘imprinted’effector function loss，几乎所有的P10d都不能产生效应细胞因子，并保留了PD-1的表达(图7b,c)。
