在临床上，非偶联抗体可以以非常高的剂量输送，使其饱和接近血管的细胞层上的受体，从而使抗体能够更远地扩散到肿瘤内部。然而，ADC的药物荷载毒性限制了给药剂量和频率，限制了肿瘤的穿透深度
抗体的肿瘤摄取受到其穿透血管速率的限制，它们往往只能穿透血管外的少数细胞层。在临床上，非偶联抗体可以以非常高的剂量输送，使其饱和接近血管的细胞层上的受体，从而使抗体能够更远地扩散到肿瘤内部。然而，ADC的药物荷载毒性限制了给药剂量和频率，限制了肿瘤的穿透深度。因此增加ADC药物肿瘤穿透能力，可能会增强其疗效，并提高临床成功率。本期小编为大家分享一篇研究报道，通过三种不同的单域抗体ADCs以及一个IgG ADC，探究它们在前列腺特异性膜抗原（PSMA）结合方面的药代动力学和治疗效果。
单域抗体ADC
研究中使用的单域抗体来自转基因重链抗体小鼠。根据要观察的不同性能，设计了三种单域抗体ADCs。
① VH2-VH1-HLE：包含三个VH域，其中两个VH识别PSMA双表位，第三个VH用于结合白蛋白延长半衰期。
② VH1-HLE：包含两个VH域，用于分析内化对ADC活性的影响。
③ VH2-VH1：包含两个VH域，用于分析半衰期对ADC活性的影响。
不同ADC抗体结合肿瘤细胞分布示意图。J591是抗PSMA的全长IgG抗体。
VH1-HLE-DGN549在体外细胞毒性最低
体外细胞毒性测定表明，快速内化的双表位ADC抗体（VH2-VH1-HLE、VH2-VH1）和J591具有最高的活性，VH1-HLE-DGN549的效力最低。双表位ADC抗体在体外的较大活性可能是由于受体表面聚集导致药物的快速内化。在单层细胞培养中，不存在药物递送的限制，因此细胞内化/载荷释放是载荷摄取的速率限制步骤，也是细胞杀伤的关键决定因素。
体外细胞毒性。细胞存活率与蛋白质浓度（A）和毒素浓度（B）之间进行绘制。基于蛋白质浓度和毒素浓度显示测得的IC50值（C）。
VH1-HLE-DGN549在体内疗效最强
在表达PSMA的裸鼠异种移植模型中所有ADC均显著抑制了肿瘤生长。与体外效力相反，VH1-HLE-DGN549在两个肿瘤模型中的疗效最好，显著高于VH2-VH1-HLE-DGN549或VH2-VH1-DGN549（图1A和B）。VH2-VH1-HLE-AF680清除速度较慢，并且肿瘤摄取显著高于VH2-VH1-AF680，在DU145-PSMA肿瘤模型中的VH2-VH1-HLE-DGN549的疗效也优于VH2-VH1-DGN549，这些表面药物暴露（即血浆AUC）与肿瘤摄取和对ADC的响应之间的相关性。
体外和体内ADC效果。高表达的DU145-PSMA异种移植模型（A）或中等表达的CWR22Rv1异种移植模型（B）。相对内化和清除速率，ADC结构（所有连接发生在C端）和体外效价（C)。
清除较慢的抗体具有较高的肿瘤摄取能力
清除较慢的VH1-HLE-AF680、VH2-VH1-HLE-AF680和J591-AF680抗体在抗原阳性的肿瘤中具有预期的高摄取能力（约30%ID/g），没有显著差异，而清除较快的VH2-VH1-AF680的摄取明显较低（约7% ID/g），图4A。VH2-VH1-AF680在抗原阴性肿瘤和所有其他器官中的摄取最低，
图4. 由于肿瘤摄取、血浆清除和体外毒性并未足够解释肿瘤生长抑制的趋势，进一步对这些药物在肿瘤内分布进行了研究。
模拟预测和球体实验显示VH1-HLE具有更好的组织穿透性
计算模型预测较小的VH1-HLE将展现出最大的肿瘤穿透性，而快速内化的VH2-VH1和VH2-VH1-HLE只会靶向球体的几个细胞层，类似于J591抗体，如图5A所示。体外使用DU145-PSMA细胞球体实验进行了验证，如图5B所示。半定量图像分析也证实了VH1-HLE-AF680相对于其他抗体具有更高穿透性，
A、基于分子量、结合动力学、亲和力和内化速率的模拟预测了抗体构建的穿透深度。B、荧光标记的抗体在球体实验中的穿透深度，组织切片染色表明PSMA在整个球体中均匀表达（红色）。C、图像分析半定量描绘穿透深度（每组6-13个球体）。表格列出抗体的结合亲和力速率和净内化速率。
组织切片显示VH1-HLE具有更好的组织穿透性
荧光标记的抗体通过静脉给药后的肿瘤组织成像显示与模型预测和球体实验中相似的分布趋势。VH2-VH1-AF680和VH2-VH1-HLE-AF680表现出有限的穿透性，类似于J591-AF680抗体，而VH1-HLE-AF680可穿透更多的细胞（图6）。J591-AF680抗体在后续72小时内也未显示出穿透的增加。荧光标记的ADC抗体显示出与没有载荷的抗体类似的分布模式，表明载荷对肿瘤分布没有影响。
图6. 荧光标记的抗体的组织分布。在尾静脉注射荧光标记的抗体24小时后，进行组织切片。Alexa Fluor 555标记血管（红色），而Alexa Fluor 680标记4种抗体（绿色）。
VH1-HLE以更低的载荷浓度作用于更多细胞
将荧光标记的ADC抗体静脉注射后24小时内的肿瘤组织处理制成单细胞悬液，通过流式分析以确定抗体分布和载荷摄取。结果表明VH1-HLE-AF680比其他抗体更多地作用于细胞（图8A），与计算模型，组织切片以及动物模型体内疗效一致。虽然VH1-HLE-AF680作用于最多的细胞，但这些细胞中的载荷数低于VH2-VH1-HLE-AF680（图8B）。
小结
四种ADC抗体（VH1-HLE，VH2-VH1，VH2-VH1-HLE和J591）的研究显示出明显不同的体外效力、组织渗透、血浆清除和疗效。结果表明单域抗体ADC的组织渗透性、血浆暴露与肿瘤反应正相关。虽然该研究证明VH1-HLE相比其他ADC抗体，具有更好的组织分布和体内疗效。但并不表示单价ADC抗体在体内总是最有效的试剂。相反，该研究强调了根据靶点特性（表达量、内化速率）、载荷（是否具有旁观效应、MTD）以及清除率来构建ADC抗体的必要性。
该研究也显示出单域抗体可为基于结合动力学、肿瘤生理学、靶点特异性表达/内化以及ADC的生物物理性质（如扩散）设计ADC抗体提供有效的研究平台。这种研究方法可以扩展到其他ADC靶向药物研究以设计高效的药物。
